Методика выполнения измерений массовой концентрации афлатоксина М1 в молоке, молочных продуктах и масле коровьем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №48-08 от 26.03.2008
ФР.1.31.2008.01731

Назад к списку методик

Описание  Комплект оборудования  Свидетельство  Хроматограммы   

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на молоко, молочные продукты и коровье масло и устанавливает определение массовой концентрации афлатоксина М1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации афлфтоксина М1 в пробах молока, молочных продуктов и коровьем масле на уровне не менее половины ПДК (0,00025 мг/кг).

ПДК М1 в молоке и продуктах его переработки регламентируется СанПин 1078-01 на уровне 0,0005 мг/кг.

3. Пробоподготовка

Отбор проб производят в чистые тщательно высушенные стеклянные емкости. Пробу взвешивают на аналитических весах (результат взвешивания записывают до четвертого десятичного знака).

Пробу сыра необходимо предварительно мелко измельчить, пробу масла – растопить. Для измельчения можно использовать мелкую кухонную терку.

Навеску сухого молока необходимо предварительно растворить в дистиллированной воде (10 г в 10 мл), подогретой до температуры 40 °С.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы; осаждения белка путем первичной экстракции афлатоксина М1 раствором натрия хлористого и лимонной кислоты при подогреве до 30–35°С и последующей экстракции хлороформом (предварительно подогретом до 30–35°С) в конической колбе; центрифугирования; переноса содержимого пробирок (без белкового осадка) в делительную воронку, дополнительной промывки белковых осадков хлороформом и переносе хлороформных слоев в делительную воронку, разделения слоев объединенных супернатантов в делительной воронке, упаривания отделенного хлороформного слоя на роторном испарителе, добавления точных объемов воды дистиллированной и гексана, разделения водного и гексанового слоев в делительной воронке, отделения водного слоя, повторного добавления к водному слою гексана, разделения слоев в делительной воронке; последующей очистки и концентрирования водного слоя (обезжиренного водного экстракта) с добавкой 5% ацетонитрила методом твердофазной экстракции на картриджах Strata C18-E, элюирования, отдувки элюента до заданного объема при температуре не выше 50°С.

Пробы хранят в холодильнике при температуре 4 – 6 °С.

Блок-схема процедуры пробоподготовки


4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов афлатоксина М1, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа афлатоксина М1 необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детекторованием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из СО афлатоксина М1 в ацетонитриле или из СО афлатоксина М1 в смеси бензола с ацетонитрилом (растворитель отдувают и перерастворяют стандартный образец в чистом ацетонитриле); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер» с флуориметрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром для Windows XP» версии 1.5 или 2х.
  • Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Synergi Polar-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: Polar-RP 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: раствор ацетонитрил/вода (2:3);
  • скорость потока: 0,8 мл/мин;
  • объем петли: 20 мкл;
  • температура: 20°С;
  • диапазон RFU: 0,005;
  • детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).
  • Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в месяц, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

    4.2. Определение количественного содержания афлатоксина М1 в пробе продукта

    Для определения количественного содержания компонента пробы продукта (афлатоксина М1) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

    Используя установленное программное обеспечение – «МультиХром для Windows XP» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

    Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания афлатоксина М1 в концентрате анализируемой пробы, мкг/л.

    Массовую концентрацию афлатоксина М1 в анализируемой пробе, мкг/л (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:

    где:
    Схр – среднее значение концентрации афлатоксина М1, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [мкг/л];
    V1 – объем элюата после проведения ТФЭ и концентрирования, часть из которого вводится в хроматограф (около 2 мл) [мл];
    Kпр – коэффициент пробоподготовки в целом, равный 0,85;
    mпр – масса пробы продукта, взятого на анализ (см. таблицу 1) [г].

    Таблица 1. Массы навесок образцов и объемы первичного раствора для экстракции.

    Наименование
    образца
    Навеска, г Объем добавляемого
    раствора для первичной
    экстракции (1), мл
    молоко 20 10
    кефир 20 10
    сметана 10 10
    творог 10 15
    масло 10 15
    сыр 10 15
    молоко сухое 10 40



    Copyright © АО "Аквилон"